박테리아 코어 게놈을 이용한 Dolosigranulum pigrum 특이적 PCR 프라이머의 설계 및 검증

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 6110(2023) 이 기사 인용

651 액세스

2 알트메트릭

측정항목 세부정보

Dolosigranulum pigrum—비강 미생물군집의 중요한 구성원으로 점차 인식되고 있는 젖산균입니다. 현재 D. pigrum 분리주를 확인하고 임상 검체에서 D. pigrum을 검출하기 위한 신속하고 저렴한 옵션이 제한되어 있습니다. 여기서 우리는 민감하고 구체적인 D. pigrum을 표적으로 하는 새로운 PCR 분석법의 설계 및 검증에 대해 설명합니다. 우리는 21 D. pigrum 전체 게놈 서열의 분석을 통해 확인된 단일 복사본 핵심 종 유전자인 murJ를 표적으로 하는 PCR 분석을 설계했습니다. 이 분석법은 D. pigrum 및 다양한 세균 분리주에 대해 100% 민감도와 100% 특이성을 달성했으며 비강 면봉을 사용하여 전체 91.1% 민감도와 100% 특이성을 달성했으며 1.0 × 104 D. pigrum 16S rRNA 유전자 복사본의 임계값에서 D. pigrum을 검출했습니다. 면봉당. 이 분석은 비강 환경에서 일반 박테리아와 전문 박테리아의 역할을 조사하는 미생물군집 연구원 툴킷에 안정적이고 신속한 D. pigrum 감지 도구를 추가합니다.

Dolosigranulum pigrum은 인간의 비강에서 흔히 발견되는 Carnobacteriaceae1 계열의 그람 양성 비포자 형성 박테리아입니다2,3. 1993년에 처음으로 베타 용혈을 보이는 작은 흰색 집락으로 기술된 D. pigrum은 아직 잘 알려져 있지 않으며 현재까지 알려진 Dolosigranulum의 유일한 종입니다. 역학적으로 D. pigrum은 비강 미생물군의 건강한 상태와 연관되어 있습니다3,4. 특히, D. pigrum에 의한 상부 기도 집락화는 황색 포도상구균 보균5,6,7,8,9와 부정적인 연관이 있습니다. 최근에는 증상이 더 심한 환자보다 무증상 SARS-CoV-2 감염 환자의 비인두에 D. pigrum이 더 많이 존재하는 것으로 밝혀졌습니다10.

향후 임상 및 시험관 연구를 촉진하려면 D. pigrum을 식별하는 신속하고 비용 효율적인 방법이 필요합니다. 표준 생화학적 방법은 시퀀싱 기반 방법과 마찬가지로 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간(MALDI-TOF) 분석은 비용 효율적이지만 임상 샘플에서 직접 D. pigrum을 검출하는 데 사용할 수 없습니다. 핵심 게놈 기반 접근 방식을 사용하여 우리는 D. pigrum 분리를 확인하고 임상 샘플에서 직접 D. pigrum의 존재를 감지하는 데 사용할 수 있는 PCR 기반 분석을 설계하고 검증했습니다.

우리는 먼저 이용 가능한 21개의 D. pigrum 전체 게놈 서열의 유전적 다양성을 분석했습니다(NCBI의 n = 7, 사내 D. pigrum 게놈의 n = 14, 표 S1). 우리는 핵심 게놈의 재조합되지 않은 영역에서 87,993개의 SNP를 추출하고 최대 가능성 계통 발생을 기반으로 유전적 다양성을 조사했습니다(그림 S1). 이는 D. pigrum의 비클론 특성과 게놈 수집의 견고성을 모두 나타내는 여러 개의 별개의 D. pigrum 계통을 보여줍니다. 그런 다음 D. pigrum 팬 게놈을 생성하고 분석하여 1291개의 핵심 유전자와 357개의 보조 유전자를 식별했습니다. 잠재적인 분석 대상을 위해 우리는 1291개의 핵심 유전자에 중점을 두었습니다.

분석 표적 유전자 발견은 다단계 과정이었습니다 (그림 1). 우리는 리보솜 유전자(n = 71)와 다른 속의 상동체를 갖는 유전자(n = 345)를 제거했습니다. 843개의 단일 복사본 핵심 종 유전자에서 무작위로 선택된 분석 대상 유전자의 수동 필터링이 수행되었으며, 분석 대상 유전자는 (a) 모든 21개의 D. pigrum 게놈에 존재해야 하며, (b) 70개 미만이어야 합니다. BLAST에 의한 비-Dolosigranulum 분류군의 서열에 대한 % 유사성 동일성 및 적용 범위, (c) Primer3 디자인 기준을 충족하는 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 포함하고 50% 미만의 유사성 동일성을 가지며 BLAST에 의한 비-Dolosigranulum 분류군의 서열에 대한 커버를 포함합니다.

분석 설계를 위한 핵심 게놈 기반 접근 방식. 분석 대상에 대한 범 게놈을 채굴하기 위해 취한 접근 방식을 도식적으로 표현합니다. 팬게놈 분석 워크플로우의 각 후속 단계는 관심 유기체에 대한 고유한 핵심 게놈을 최종적으로 유지하기 위해 유전자를 필터링하는 방법을 보여줍니다.